Глюкокортикоидите са мощни хормони на стреса, които модулират въглехидратния, липидния и протеиновия метаболизъм на тялото в отговор на външни или циркадни стимули. Синтетичните глюкокортикоиди като преднизон се използват като противовъзпалителни средства за състояния, вариращи от ревматоиден артрит до мускулна дистрофия до астма. Терапевтичните ползи от глюкокортикоидите се възпрепятстват от обширни странични ефекти, особено когато се приемат хронично, и тези странични ефекти включват инсулинова резистентност и мускулна слабост ( 1 ). Известно е, че хроничното лечение с глюкокортикоиди предизвиква атрофия на скелетните мускули чрез стимулиране на експресията на атроген (2 ,3 ), и въпреки това, глюкокортикоидите все още се използват широко поради тяхната ефективност като противовъзпалителни средства.

Глюкокортикоидите упражняват своите ефекти чрез глюкокортикоидния рецептор (GR). При свързване на лиганда GR се освобождава от шаперонов комплекс в цитоплазмата и се транспортира в ядрото, където свързва елементите на глюкокортикоидния отговор (GREs) близо до целевите гени. GR взаимодейства с разнообразна група от коактиватори и корепресори, за да регулира експресията на целевия ген по специфичен за тъканта и стимула начин ( 4 ,5 ). Ролята на GR като противовъзпалителен транскрипционен фактор е добре очертана (6 ,7 ). В мускулите глюкокортикоидите и GR са добре характеризирани в насърчаването на атрофия на скелетните мускули (3 ,8 –10 ). При високи или хронични схеми на дозиране, глюкокортикоидите активират протеазомния път на убиквитин, регулирайки нагоре мускулно-специфичните убиквитин лигази MuRF-1 и атрогин-1, които директно увеличават медиираното от полиубиквитиниране разграждане на протеини и инициират мускулна загуба (11 ,12 ). Едновременно с това, тези високи дози глюкокортикоиди инхибират мишената на рапамицин (mTOR) при бозайниците (13 –15 ), което води до намален протеинов синтез.

Глюкокортикоидите са използвани за подобряване на мускулната производителност и/или подобряване на възстановяването от нараняване, често в кратки режими на дозиране, за които се смята, че действат чрез противовъзпалителни свойства ( 16 ). Проучвания, изследващи по-ниски дози и краткотрайна експозиция на глюкокортикоиди, са открили противоречиви резултати в работата на скелетните мускули, вероятно свързани с различни схеми на дозиране. Установено е, че еднократна доза или краткосрочно дозиране, за по-малко от 1 седмица, води или до липса на промяна, или до умерени подобрения в спортните постижения и при двата човека (16 ) и мишки (17 ,18 ). При мишки хроничният режим на дозиране веднъж седмично подобрява мускулната сила и издръжливост при модели на мускулна дистрофия на Дюшен (DMD) и мускулни дистрофии на пояса на крайниците 2B и 2C (19 ,20 ). Молекулярните механизми, отговорни за тази полза за мускулите, вероятно са многобройни и проучванията върху миши модели на DMD показват, че транскрипционният фактор KLF15 е от значение при болните мускули (17 ,20 ). Малко от проучванията, изследващи дозирането на глюкокортикоидите и отговора, са взели под внимание полово-специфичните отговори, въпреки че скелетните мускули са силно сексуално диморфна тъкан и наблюденията на полово-специфични транскрипционни програми, управлявани от глюкокортикоиди в други тъкани (21 ).

За да изследваме как дозирането на преднизон влияе върху експресията на атроген и мускулната ефективност, ние лекувахме група от мъжки и женски възрастни мишки с веднъж седмични или дневни дози преднизон в продължение на 1 месец и след това оценихме функцията на скелетните мускули и генната експресия. Установихме, че ежедневното лечение с преднизон води до намалена специфична сила и повишена експресия на атроген както при мъже, така и при жени. За разлика от това, третирани веднъж седмично с преднизон мишки от двата пола показват повишена специфична сила, повишен АТФ на скелетните мускули и липса на повишаване на експресията на атроген. Когато изследвахме транскриптома на скелетните мускули на тези животни, открихме, че мъжките и женските мишки нямат почти никакви общи гени, реагиращи на седмичния преднизон. Вместо това изглежда, че мъжкият скелетен мускул реагира на седмичния преднизон с гени, замесени в хипертрофия и подобрена обработка на калций, докато женските експресират гени, подчертаващи метаболитно изместване към повишено използване на липидите. Открихме доказателства за специфичен за пола GR ДНК-свързващ модел, в съответствие със седмичния преднизон, подобряващ мускулната ефективност чрез независими механизми при мъжки и женски мишки.

Седмичното лечение с глюкокортикоиди подобрява силата и при двата пола. Мъжки и женски 10-седмични C57BL/6J мишки бяха третирани със седмични или ежедневни инжекции на преднизон (1 mg/kg ip) в продължение на 4 седмици ( Фигура 1А ). В края на лечението анализирахме мускулната сила, времето за релаксация и свиване и реакцията на повтаряща се сила в предните тибиални мускули на всяка група. Ежедневното лечение с преднизон предизвиква сравнима атрофия както при мъжки, така и при женски мишки, което води до намалена максимална тетанична и специфична сила, увеличено време на контракция и релаксация и намалена сила при последователни пристъпи на изометрична контракция ( Фигура 1, B–F ). За разлика от това, седмичното лечение с преднизон подобрява мускулната ефективност във всички показатели, което предполага, че за разлика от ежедневния преднизон, седмичното излагане на преднизон не предизвиква атрофия. Седмично третирани с преднизон мъже и жени имат значително повече ATP и NAD+ на милиграм тъкан в сравнение с третирани с носител животни ( Фигура 1, G и H ). Животните, третирани ежедневно, имат значително по-малко ATP и NAD+, отколкото животните, третирани с носител, което отразява тяхното атрофично състояние. Нито ежедневното, нито седмичното лечение с преднизон повлиява нивата на кръвната глюкоза или серумния инсулин ( допълнителна фигура 1, A и B ; допълнителен материал, достъпен онлайн с тази статия; https://doi.org/10.1172/JCI14982DS1 ). Известно е, че хроничното лечение с екзогенни глюкокортикоиди потиска ендогенните глюкокортикоиди и ние наистина открихме, че ежедневното лечение води до значително намаляване на циркулиращия кортикостерон ( допълнителна фигура 1C ). Седмичният преднизон не потиска циркулиращия кортикостерон. За да оценим ефекта на седмичния преднизон върху напълно зрели животни, отделно третирахме кохорта от 18-седмични мишки в продължение на 4 седмици и установихме, че те реагират на седмичния преднизон по подобен начин ( допълнителна фигура 2 ).

Глюкокортикоидите работят основно чрез техния рецептор, GR, ядрен рецепторен транскрипционен фактор. Ние предположихме, че разликите, които наблюдаваме между животни, третирани ежедневно и седмично с преднизон, са резултат от различни транскрипционни профили. За да проучим това, извършихме секвениране на РНК (RNA-Seq) върху миофибри, изолирани от четириглавия мускул на мъжки и женски животни от всяка група за лечение. След филтриране за изходна експресия, вариабилност и log ₂ (кратна промяна), в ежедневно третираните с преднизон мускули 1777 гена са променени при мъже и 1224 гена при жени в сравнение с третирани с носител животни от всеки пол ( Фигура 2А ). По-малко от половината гени са споделени между половете ( Фигура 2B ). За разлика от това, в мускулите, третирани с преднизон ежеседмично, 407 и 406 гена са променени съответно при мъже и жени ( Фигура 3A ) и повечето са уникални за един пол ( Фигура 3B ). Попитахме колко гена са имали различен отговор към 2-те лечения, т.е. регулирани нагоре от едното и регулирани надолу от другото, и по-голямата част от гените са имали една и съща насоченост на транскрипционния отговор след ежедневен и седмичен преднизон (квадранти 2 и 4, Фигура 2C ), което предполага, че транскрипционните профили са като цяло сходни между ежедневното и седмичното лечение. Наистина открихме, че ежедневният спрямо седмичният преднизон има различни ефекти върху експресията на каноничните медиатори на атрофия, предизвикана от глюкокортикоиди. Експресията на гените, кодиращи MuRF-1 ( Trim63 ) и атрогин-1 ( Fbxo32 ), е непроменена в седмично третиран мускул в сравнение с третирания с носител, но тези атрофични гени са регулирани нагоре в ежедневно третиран мускул ( Фигура 2D ). В мускулите, лекувани ежедневно с преднизон, наблюдавахме силно понижено регулиране на гените, кодиращи митохондриалния респираторен комплекс ( Фигура 2E ). Взети заедно, тези резултати предполагат, че ежедневното и седмичното лечение с преднизон предизвикват някои подобни транскрипционни ефекти в скелетните мускули, но ежедневната експозиция на преднизон се отличава с модела на атрофична генна експресия.

След като наблюдавахме прилики в транскрипционния отговор между ежедневния и седмичния преднизон, бяхме любопитни дали прилагането на преднизон два пъти седмично би подобрило седмичния преднизон или ще доведе до ефект, по-подобен на ежедневната експозиция. Лекувахме мъжки и женски мишки с преднизон два пъти седмично в продължение на 3 седмици ( допълнителна фигура 3A ). При лечение два пъти седмично и двата пола имат значително повече скелетни мускули NAD+ в сравнение с носителя, докато само женските мускули имат значително повишено ATP ( допълнителна фигура 3, B и C ). Гените, реагиращи транскрипционно на преднизон веднъж седмично, реагираха по подобен начин на веднъж седмично ( допълнителна фигура 3D-G ), което предполага, че докато преднизон, прилаган два пъти седмично, не се подобрява спрямо веднъж седмично, той също не предизвиква атрофия. Това беше допълнително потвърдено чрез количествена PCR (qPCR) за Fbxo32 и Trim63 , които не бяха регулирани нагоре след лечение с преднизон два пъти седмично ( допълнителна фигура 3H ).

Мъжете и жените имат различни транскрипционни отговори на седмичното лечение с глюкокортикоиди. По-голямата част от транскрипционния отговор на седмичното лечение с преднизон беше чрез повишена генна експресия, което предполага, че седмичните глюкокортикоиди могат да се разглеждат предимно като активиращ стимул. От тези повишени гени, мнозинството (87,2% при жените, 88,4% при мъжете) са уникални за един пол ( Фигура 3B ). Гени, регулирани нагоре при жени, лекувани седмично с преднизон, участват предимно в пътищата на липидния метаболизъм (тъмно лилаво, Фигура 3C ); въпреки това, гените, регулирани нагоре при седмично третирани мъже, са включени в мускулната функция и пътищата на растеж, като PI3K/AKT сигнализиране и регулиране на калций (оранжево, Фигура 3C ). За да идентифицираме всякакви асоциации между транскрипционните и физиологичните отговори към седмичния преднизон, ние приложихме Pheno-RNA, метод, който свързва гените с фенотипните резултати (22 ). В сравнение с група контролни гени, гените, реагиращи на седмичен преднизон, са по-силно свързани със специфичната сила и времето за релаксация при мъжете ( Фигура 3D ) и специфичната сила и времето на свиване при жените ( Фигура 3E ). Когато попитахме доколко определени пътища корелират с физиологичния резултат, открихме, че сигналните гени PI3K/AKT при мъжете са по-корелирани със специфичната сила, отколкото имунните сигнални гени, въпреки че и двата пътя са значително повишени в отговор на седмичния преднизон. Гените за обработка на калция са по-свързани с времето за релаксация, отколкото гените за имунна сигнализация при мъжете. При жените гените за липидния метаболизъм са по-корелирани със специфичната сила и времето на свиване, отколкото гените за имунна сигнализация. Като цяло открихме, че специфичните за пола транскрипционни отговори на седмичния преднизон силно корелират с подобренията в работата на скелетните мускули.

Пътят на IGF1/PI3K е преди mTOR и е известно, че регулира хипертрофията на миофибрите ( 23 –25 ). Количествена PCR с обратна транскрипция (RT-PCR) потвърди регулирането нагоре на гените, членуващи в пътя на IGF1/PI3K, в мъжки, но не и женски мускули ( Фигура 4А ). mTOR е след IGF1/PI3K, където фосфорилира целевите протеини S6K и 4EBP1 (26 ). Общите протеинови нива на S6K и 4EBP1 бяха значително повишени в седмично третиран мъжки мускул, но бяха намалени в седмично третиран с преднизон женски мускул ( Фигура 4B ). Нивата на фосфорилиран 4EBP1 са леко повишени в седмично третирани с преднизон мъжки мускули, което води до поддържано съотношение p-4EBP1/4EBP1. Женският мускул има увеличение в съотношението p-4EBP1/4EBP1, вероятно за да компенсира намаляването на общия 4EBP1. Измерихме площта на напречното сечение на миофибъра в предния тибиален мускул, като индикатор за хипертрофия; седмично третирани с преднизон мъже имат тенденция към увеличена площ на напречното сечение в сравнение с третирани с носител мъже, докато няма разлика между женските групи ( Фигура 4C ).

Анализът на генната онтология (GO) на гени, регулирани нагоре в мъжките мускули, също идентифицира обогатяване на гени, участващи в обработката на калций ( Фигура 3C ). Количествената RT-PCR потвърди, че гените, кодиращи SERCA2 ( Atp2a2 ), калсеквестрин ( Casq2 ), тропонин ( Tnnc1 , Tnni1 и Tnnt1 ) и канала Ca _v 3.2 ( Cacna1h ), са били регулирани нагоре чрез седмично лечение с глюкокортикоиди при мъже, но са били непроменени или регулирани надолу при жените ( Фигура 5А ). Протеиновите нива на изоформи 1 и 2 на калсеквестрин не са променени в отговор на седмично лечение при мъже, въпреки че SERCA2 изглежда е повишен ( Фигура 5B ). Обратно, нивата на двете изоформи на калсеквестрин са намалени при седмично третирани жени. За да оценим как тези генни експресии и протеинови промени могат да повлияят на обработката на калций, ние изследвахме калциевите преходни процеси при 40 Hz в изолирани миофибри на flexor digitorum brevis (FDB). Седмично третирани мъже имат повишена скорост на освобождаване на калций в сравнение с третирани с носител мъже, докато женските нямат промяна ( Фигура 5C ). Седмично третирани мъже също имат повече влакна, достигащи 50% покачване с първия електрически стимул в сравнение с третирани с носител мъже, докато седмично третирани жени имат по-малко ( Фигура 5D ). Като цяло, тези данни предполагат, че мъжете са подобрили обработката на калций и са увеличили активността на пътя на IGF1/PI3K в отговор на седмично лечение с глюкокортикоиди, докато жените не.

Седмично лечение променя липидния метаболизъм при жените, което води до повишена издръжливост. GO анализ на гени, регулирани нагоре в женски мускули след седмичен преднизон, подчертава обогатяване на пътища, свързани с липидния метаболизъм ( Фигура 3C ). Въпреки че експресията на някои гени на липидния метаболизъм беше леко увеличена при седмично третирани мъже, седмично третирани жени показаха уникална и силна регулация на гени, участващи в бета окислението, образуването на липидни капки, липолизата и свързването и транспортирането на мастни киселини ( Фигура 6А ). Тези промени в експресията бяха потвърдени чрез количествена RT-PCR ( допълнителна фигура 4 ). След 4 седмици лечение с глюкокортикоид, седмично третирани женски имат намален процент мастна маса в цялото тяло, докато седмично третирани мъже са непроменени в сравнение с третирани с носител животни ( Фигура 6В ). Тези разлики могат да се видят в размера на подложката на висцералната мазнина, която е много по-малка при седмично третирани жени в сравнение с третирани с носител жени и всички мъже ( Фигура 6C ). Интересното е, че тази разлика изглежда се дължи на размера на адипоцитите; площта на напречното сечение на адипоцитите във висцералната мазнина е значително намалена при седмично третирани жени ( Фигура 6D ). Отразявайки промяна в метаболитното състояние, увеличеният процент миофибри в мускулите на тибиалиса антериор на седмично третирани жени е положителен за ензимна активност на сукцинат дехидрогеназа ( Фигура 6E ), без никаква свързана промяна в типа на влакното ( Фигура 6F ).

За да изследваме въздействието на седмичния преднизон и свързаните промени в липидния метаболизъм върху липидния профил на скелетните мускули, ние извършихме нецеленасочена липидомия върху цели квадрицепси от жени, лекувани с носител и седмично. Като цяло, само 26 (4,8%) от 536 профилирани липидни съединения са значително различни между третирани с носител и седмично жени, повечето от които са глицериди и фосфолипиди. Триглицеридите са преобладаващата форма на съхраняваните липиди в скелетните мускули и се насочват към бета окисление чрез техния катаболизъм в свободни мастни киселини. Количествената RT-PCR демонстрира повишена регулация на гени, кодиращи ензими, участващи в катаболизма на глицеридите и синтеза на ацил-КоА след седмичен преднизон ( Фигура 7А ). Ди- и триглицеридните видове са значително намалени при седмично третирани женски ( Фигура 7B и Допълнителна таблица 4 ), което допълнително предполага, че този път е активиран от преднизон веднъж седмично. Фосфолипидите фосфатидилхолин (PC) и фосфатидилетаноламин (PE) са основните компоненти на митохондриалните мембрани на скелетните мускули (27 ,28 ). Гените, кодиращи ключови ензими, участващи в синтеза на PC, бяха регулирани нагоре от седмичния преднизон ( Фигура 7C ), а PC и PE видовете бяха значително увеличени при седмично третирани женски ( Фигура 7D и Допълнителна таблица 4 ). Тези данни показват фина, но значителна промяна в липидния метаболизъм на скелетните мускули след седмично преднизон.

След това тествахме дали издръжливостта при упражнения, за която е известно, че се влияе от липидния метаболизъм ( 29 –31 ), е променен от този лекарствен режим. Лекувахме група женски мишки с преднизон в продължение на 3 месеца и след това оценихме разстоянието на бягане до изтощение в 3 времеви точки. Отбелязаната по-рано промяна в състава на тялото към повишена чиста маса се поддържа през 3 месеца лечение ( Фигура 8А ). Седмично лекуваните жени имат значително увеличено разстояние до изтощение след 6 месеца седмичен прием на преднизон ( Фигура 8B ), с по-малко стимули, необходими за километър пробег ( Фигура 8C ). Въпреки че техните висцерални мастни възглавнички вече не са значително по-малки от жените, третирани с носител след 9 месеца лечение ( Фигура 8D ), третираните всяка седмица жени все още имат значително по-малки адипоцити ( Фигура 8E ). Някои, но не всички, от гените на липидния метаболизъм, транскрипционно регулирани нагоре от 4 седмици седмичен преднизон, все още са регулирани нагоре в женския мускул след 9 месеца лечение ( Фигура 8F ). Като цяло, ние наблюдавахме значителни промени в липидния метаболизъм на седмично третирани жени, включително увеличаване на експресията на бета окислителни гени, катаболизъм на триглицеридите и изобилие от фосфолипиди на митохондриалната мембрана, както и намален процент мастна маса в цялото тяло, което води до подобрена издръжливост.

Специфичният за пола отговор към седмичния преднизон се отменя от антагонизма на половите стероиди. Глюкокортикоидите регулират експресията на таргетния ген чрез свързване с GREs, процес, модериран от много кофактори, включително андрогенния рецептор (AR) и естрогенния рецептор (ER). Както тестостеронът, така и естрогенът бяха леко повишени в серума в отговор на седмично лечение ( Фигура 9А ) и експресията на гените, кодиращи техните рецептори, беше специфично за пола чувствителна към седмичния преднизон ( Фигура 9В ). За да изследваме ролята на тези рецептори в отговора на седмичния преднизон, ние третирахме мъжки мишки с AR конкурентен антагонист флутамид и женски мишки с ER конкурентен антагонист фулвестрант в допълнение към носител или седмичен преднизон, започвайки на 10-седмична възраст ( Фигура 9C ). Четири седмици ежедневно лечение с флутамид значително намалява телесното тегло и мокрото тегло на простатата, докато ежедневният фулвестрант значително намалява влажното тегло на матката, но не повлиява телесното тегло ( допълнителна фигура 5, A и B ). Когато се прилага заедно с антагонисти на полови стероиди, седмичният преднизон не успява да повиши ATP и NAD+ в мускулите ( Фигура 9, D и E ) и не намалява процента мастна маса на цялото тяло или площта на напречното сечение на адипоцитите при женски мишки ( Фигура 9F и допълнителна фигура 5C ). Седмичният преднизон не стимулира повишена регулация на Ar ( Фигура 9G ), IGF1/PI3K път ( Фигура 9H ) или гени, управляващи калций ( Фигура 9I ) при мъже, лекувани едновременно с флутамид, което предполага, че AR е необходим за мъжкия специфичен транскрипционен отговор към седмичния преднизон. Интересно, както Ar , така и Esr1 бяха регулирани нагоре при жени, лекувани едновременно с фулвестрант ( Фигура 9G ), както и членовете на пътя на IGF/PI3K Igf1 и Itga3 ( Фигура 9H ) и липидният транспортер Slc27a1 ( Фигура 9J ). Други гени на липидния метаболизъм, за които по-рано беше доказано, че отговарят на седмичен преднизон, не бяха регулирани нагоре, когато жените бяха лекувани едновременно с фулвестрант, което предполага, че само част от специфичния за жената транскрипционен отговор на седмичен преднизон се модулира от ER.

Седмичният преднизон предизвиква специфични за пола промени в хроматина. За по-нататъшно изследване на специфичния за пола отговор към седмичния преднизон, ние извършихме хроматинова имунопреципитация (ChIP) за GR, използвайки мускули, третирани с носител и седмично. Изследвахме установени или вероятни GRE в следните целеви гени: Cidea , Cidec , Esr1 , Pik3c2a , Pik3ca и Tnnc1 ( 32 –35 ). За гените без предварително идентифицирани GREs ( Akt1 , Ar , Slc27a1 и Tnnt1), ние изследвахме свързването при последователности, съответстващи на GR консенсусния мотив, ACAnnnTGT, разположен в рамките на 10 kb от началното място на транскрипция на целевия ген. GRE в близост до гените на липидния метаболизъм са увеличили свързването на GR при седмично лекувани с преднизон жени в сравнение с носител, докато седмично третирани с преднизон мъже нямат промени в заетостта на GR ( Фигура 10А ). За мъжките мускули, GRE в близост до пътя на IGF1/PI3K и гените, управляващи калций, са обогатени ( Фигура 10, B и C ), включително добре характеризиран GRE, за който е известно, че модулира експресията на Cacna1h . Тези резултати демонстрират специфични за пола профили на свързване на GR, съответстващи на сексуално диморфните транскрипционни модели.

Ние изследвахме GR свързването 2 дни след последната седмична инжекция; нашите констатации съответно представляват относително краткосрочен отговор на преднизон, който има пълен телесен клирънс за 24 до 36 часа при възрастни хора ( 36 ). За да разберем по-добре как седмичният преднизон влияе върху архитектурата на хроматина и колко дълго се поддържат тези промени, ние третирахме група мишки в продължение на 4 седмици и след това събрахме квадрицепсите 4, 6 и 8 дни след последната инжекция ( Фигура 11А ). Извършихме ChIP-Seq за хистонова модификация H3K27ac върху изолирани миофибри, за да идентифицираме активни енхансери ( допълнителна фигура 6, A–C ). Бяхме особено заинтересовани от подобрители, присъстващи 4 дни след последната седмична инжекция, но отсъстващи в проби, третирани с носител, които идентифицирахме като преднизон-отзивчиви подобрители (PRE). PREs са предимно интергенни или интронични и малко са споделени между мъже и жени ( Фигура 11, B и C ). Попитахме колко PRE остават на 6 или 8 дни след последната инжекция. Въпреки че по-голямата част от мъжките PRE са били загубени до ден 6, женските са поддържали някои PREs до ден 8 ( Фигура 11D ). Когато присвоихме 500-те най-високо класирани PRE на техния най-близък промотор, открихме, че мъжете имат PRE близо до гени, замесени в мускулната функция и сигнализирането на ядрения рецептор, докато женските имат PRE близо до гени, участващи в сигнализирането на IGF1/PI3K ( допълнителна фигура 6D ). Тези PREs, поддържани при жени на ден 8, са били близо до гени, участващи както в липидния метаболизъм, така и в сигнализирането на IGF1/PI3K ( допълнителна фигура 6E ). Подобно на предишно изследване на дистрофичен мъжки мускул (20 ), най-значимите мотиви на транскрипционен фактор, обогатени с дълготрайни PRE и при двата пола, са членове на семейството MEF2 ( допълнителна фигура 6, F и G ).

След това изследвахме обогатяването на H3K27ac при GREs със специфично за пола свързване 2 дни след последната инжекция ( Фигура 10 ). Три от тези GRE припокриват енхансер, който присъства във всички животни, включително тези, третирани с носител, което предполага, че тези енхансери са имали базова активност, която е допълнително модулирана от седмичния преднизон (сива кутия, Фигура 11E и Допълнителна Фигура 6B ). Някои GREs със специфично за пола свързване на GR при мъже на ден 2 не са имали обогатяване с H3K27ac на ден 4 ( Фигура 11F ), което предполага, че тези подобрители реагират временно на седмичния преднизон. Преходна заетост на усилвателя също се наблюдава при специфични за жени GREs ( Фигура 11G ). Отразявайки цялостната продължителност на женския отговор към седмичния преднизон, ние идентифицирахме PRE близо до специфични за жените гени, които се поддържат до ден 8 ( Фигура 11H ). Като цяло, тези резултати предполагат, че мъжките и женските скелетни мускули претърпяват диференциално ремоделиране на хроматина в отговор на седмичния преднизон. Докато мъжете са имали относително преходен отговор към седмичния преднизон, който в повечето случаи е изчезнал до 6 дни след края на лечението, женските скелетни мускули са имали по-устойчиви хроматинови следи, които са били очевидни повече от седмица след прекратяване на лечението. Интересното е, че тези по-дълготрайни подобрители анотират не само към гени, участващи в специфични за жените пътища, като липидния метаболизъм, но също така и специфични за мъжете пътища, като IGF1/PI3K сигнализиране.

Седмичният преднизон избягва задействането на пътищата на атрофия. Седмичният преднизон повишава мускулната ефективност, докато ежедневният преднизон предизвиква значителна мускулна атрофия. Наблюдавахме значителни подобрения в специфичната сила в сравнение с животни, третирани с носител, което е подобно на проучванията на анаболни стероиди като тестостерон ( 37 ) и нандролон (38 ,39 ). Въпреки че има значително припокриване на транскрипционните профили от седмично и ежедневно лекувани с преднизон мускули, само ежедневната експозиция на преднизон предизвиква повишена регулация на атроген и канонична атрофия, предизвикана от глюкокортикоиди (2 ). Повишаването на атрогена е придружено от дълбоко потискане на гените на митохондриалната респираторна верига при ежедневно третирани с преднизон мишки и това е в съответствие с известната роля на хроничното глюкокортикоидно лечение за потискане на митохондриалното окисление (40 ). Не е известно дали намаляването на митохондриалните окислителни гени е резултат от прякото действие на GR или косвен страничен ефект на атрофия. Веднъж седмично преднизон не предизвиква същата атрогенна регулация като ежедневното лечение със стероиди, като по този начин осигурява много от положителните адаптивни промени без неблагоприятни последици.

Сексуален диморфизъм в отговор на седмичен преднизон. По-голямата част от гените, реагиращи на седмичния преднизон, са регулирани нагоре уникално при един пол. Известно е, че скелетните мускули са една от най-сексуално диморфните тъкани в тялото. Мъжете и жените проявяват големи разлики, вариращи от състава на фибрите до метаболизма и генната експресия ( 41 –45 ). Проучвания, изследващи молекулярните ефекти на глюкокортикоидите върху скелетните мускули, често са били оценявани при един пол (2 ,17 ,46 ) или с резултати от двата пола, анализирани в съвкупност, като липсват биологичните ефекти на специфичните за пола реакции (3 ,19 ,20 ). Изследвания върху черния дроб (21 ) и по-скоро в кожата (47 ) предполагат, че мъжките и женските могат да имат различни отговори на лечението със синтетични глюкокортикоиди. Мъжкият мускул се характеризира с повишено активиране на IGF1/PI3K сигнализиране, път, силно замесен в мускулния растеж (25 ). Ние също така идентифицирахме ролята на обработката на калция в отговора на мъжете към седмичния преднизон. Доказано е, че глюкокортикоидите увеличават навлизането на калций в магазина (48 ), както и контрактилната сила в изолирани кардиомиоцити (49 ) и модела на мишката на DMD (50 ), осигурявайки допълнителна поддръжка за този механизъм за подобрена производителност. Въпреки че наблюдавахме специфични за мъжете подобрения в генната експресия и скоростта на освобождаване на калций, и двата пола реагираха на седмичния преднизон със значително намалено време за мускулна релаксация. Ние подозираме, че тези подобрения в представянето на женските скелетни мускули са резултат от повишен АТФ, цитоплазмената концентрация на който е известно, че медиира времевия ход и амплитудата на тетаничната сила (51 ). Ползите, предлагани от предизвиканото от преднизон повишено съдържание на АТФ в женския мускул, могат да бъдат наблюдавани само от механиката на целия мускул и твърде фини, за да бъдат оценени в единични миофибри, и е необходимо допълнително проучване, за да се изследва тази важна връзка. Въпреки че не идентифицирахме директно източника на повишен АТФ, е доказано, че производството на АТФ в мускулите се стимулира от IGF1 сигнализиране (52 ), митохондриален калций, поет от саркоплазмения ретикулум (53 –55 ) и фосфолипиден състав на митохондриалната мембрана (56 ), всички от които бяха подобрени от седмичния преднизон. Необходимо е обаче по-нататъшно изследване, за да се изясни точно как тези пътища специфично модулират специфичната сила независимо от размера на влакното.

Специфични за жените подобрения в липидния метаболизъм и издръжливостта. Глюкокортикоидите са добре описани регулатори на бялата мастна тъкан, модулиращи както диференциацията на адипоцитите, така и индуцираната от гладуване и хормони липолиза ( 57 ,58 ). Острата или краткотрайна експозиция на глюкокортикоиди по-специално е идентифицирана като медиатор на липолизата от адипоцитите (59 –61 ). Наблюдавахме намаляване на размера на адипоцитите, размера на висцералната мастна тъкан и процента на мастната маса на цялото тяло при седмично лекувани жени, но не и мъже. Скелетните мускули на седмично третирани жени показват силна регулация на гени, свързани с липидния метаболизъм, за които преди това беше съобщено, че отговарят на глюкокортикоиди в мастната тъкан (35 ) и като имащи полово диморфно изразяване в скелетните мускули (62 –66 ). Този изходен полов диморфизъм е предложен като обяснение защо, въпреки че упражненията за издръжливост предизвикват промяна към повишено използване на липиди и при двата пола, ефектът е по-силен при жените, които имат по-нисък коефициент на респираторен обмен и използват 25% до 50% по-малко гликоген от мъжете, в зависимост от вида на упражненията и мускулната група (41 ,67 –69 ). Липидният профил на седмично третирани жени показа подобрения, които отразяват тези, наблюдавани при тренирани мускули. Както PC, така и PE реагират на интервенция с упражнения (70 ) и добавянето на PE към митохондриалната мембрана на скелетните мускули е доказано, че насърчава митохондриалния респираторен капацитет (56 ). Ние също така наблюдаваме повишена експресия на ензими за синтез на PC, включително Chpt1 , което е доказано чрез нокаут, специфичен за скелетните мускули, че е от решаващо значение за толерантността към упражнения ( 71 ). Сексуалният диморфизъм в генната експресия на липидния метаболизъм на скелетните мускули се дължи отчасти на разликите във вида на влакната, а женските мускули са склонни да имат по-висок процент окислителни влакна, отколкото мъжките мускули (43 ,72 –75 ). Наблюдавахме, че женският мускул има малко по-висок процент влакна от тип 2А, отколкото мъжкият мускул (съответно 15,2% и 9,8% от предния тибиален мускул), но не наблюдавахме значителни промени в състава на влакната в отговор на седмичния преднизон. Относително малкият принос на влакната от тип 2А вероятно е недостатъчен, за да отчете функционалните подобрения след седмичния преднизон.

Половите хормони влияят на мускулния размер и контрактилитета, метаболизма и реакцията към упражнения ( 45 ,76 –79 ). GR и рецепторите за полови стероиди са членове на едно и също суперсемейство, способни да се свързват кооперативно (80 ) или споделяне на кофактори (81 ), и ние предположихме, че AR и ER са отговорни за насочването на специфичното за пола GR свързване. Когато AR беше антагонизиран, мъжкият мускул не успя да реагира на седмичния преднизон, което предполага, че AR е кофакторът, медииращ мъжкия отговор на седмичния преднизон. Интересно е, че ежеседмично преднизон, прилаган на женски мишки, третирани с ER антагонист, води до регулиране нагоре на преди това мъжки специфични гени като Ar и Igf1 . Ние също така открихме, че женските миофибри, третирани само със седмичен преднизон, имат H3K27ac обогатяване при мъжки специфични GRE. Възможно е женският специфичен транскрипционен профил да е резултат от директно активиране на женски специфични гени и потискане на мъжки специфични гени; необходимо е по-нататъшно изследване, за да се изясни дали ER е директен медиатор и на двете от тези генни регулаторни програми.

Последици за клиничната употреба на глюкокортикоиди. Тази работа се фокусира върху мускулния отговор на седмичната експозиция на преднизон между мъже и жени, но глюкокортикоидите се предписват предимно като противовъзпалителни лекарства. Дали има полово диморфични разлики в отговора на възпалението е възможно и може да е по-уместно в контекста на заболяването или нараняването. Други неблагоприятни ефекти на глюкокортикоидите също могат да проявят сексуално диморфни реакции. Например централното затлъстяване е често срещан страничен ефект от хроничното лечение с глюкокортикоиди ( 82 ), но нашите данни показват намаляване на мастната маса и размера на адипоцитите само при жени. Остеопорозата е много значима неблагоприятна последица от употребата на стероиди, а също така е известно, че костите имат силно хормонално влияние и полов диморфизъм. Индуцираната от глюкокортикоиди остеопороза отчасти се дължи на намалена остеобластна функция чрез потискане на IGF1 (83 ), чиято експресия е значително повишена при седмично третирани мъже, но не и жени.

Като цяло нашите данни показват, че седмичното лечение с глюкокортикоиди е полезно за здравето и ефективността на скелетните мускули. Въпреки че мъжките и женските мишки показват подобни подобрения в силата, механизмите, чрез които те постигат това, са много различни, водени от различни профили на генна експресия, свързани със специфични разлики в заетостта на хроматина на GR. Тази работа има значителни последици предвид широко разпространената природа на хроничната употреба на глюкокортикоиди.

животни. Мъжки и женски мишки C57BL/6J бяха получени от The Jackson Laboratory на възраст 8 седмици. Мишките се аклиматизират в продължение на 2 седмици преди началото на лечението. Мишките бяха разпределени на случаен принцип в кохорти за лечение. Освен ако не е посочено друго, всички животни са били на възраст 10 седмици в началото на лечението. За дългосрочни експерименти, мишките бяха разпределени в група за лечение въз основа на първоначалното тегло и процент мастна маса, така че всяка група за лечение започна със същата средна телесна маса и среден процент мастна маса. Мишките бяха настанени в специфично свободно от патогени съоръжение и се поддържаха на 14-часов цикъл на светлина/10-часов тъмнина, като светлинният цикъл започваше в 6 сутринта.

Лекарствени лечения. Преднизон (P6254, Sigma-Aldrich) се ресуспендира в DMSO (D4540, Sigma-Aldrich) при 5 mg/mL всяка седмица. Ежедневното лечение беше 1 mg/kg телесно тегло преднизон в 50 μL PBS, прилаган всеки ден чрез ip инжекция. Третирането с носител беше еквивалентно количество DMSO, пропорционално на телесното тегло в 50 μL PBS. Седмичното лечение беше 1 ден лечение с преднизон (1 mg/kg преднизон в 50 μL PBS) и 6 последващи дни лечение с носител (DMSO в 50 μL PBS). Неанестезирани мишки се инжектират ежедневно в 7 часа сутринта със стерилни BD Micro-Fine IV инсулинови спринцовки (14-829-1A, Thermo Fisher Scientific). Мишките се претеглят всяка седмица и телесното тегло се използва за изчисляване на дозировката. Краткосрочните (4-седмични) лечения се състоят от общо 5 седмични инжекции с преднизон, като последната инжекция се дава 2 дни преди умъртвяването. Дългосрочните (38-седмични) лечения се състоят от общо 39 седмични инжекции с преднизон, като последната инжекция се дава 2 дни преди умъртвяването. Активността на AR се потиска чрез конкурентния антагонист флутамид (F9397, Sigma-Aldrich), който се прилага при 15 mg/kg в 90% царевично масло/10% етанол. ER активността се потиска чрез конкурентния антагонист фулвестрант (I4409, Sigma-Aldrich), който се прилага при 5 mg/kg в 95% царевично масло/5% DMSO. Антагонистите на половите стероидни рецептори се прилагат ежедневно като 100-μL ip инжекции.

Мускулна механика, бягаща пътека и състав на тялото. In situ тетаничната сила и времето на свиване и релаксация от предния тибиален мускул бяха оценени в 9 сутринта непосредствено преди умъртвяването, като се използва цяла система за тестване на мишка с 1-N преобразувател на силата на рамото с двойно действие с двойно действие (300C-LR, Aurora Scientific). Мишките бяха анестезирани с 3% изофлуран в 100% О2 _и тетаничната сила и времето на свиване и релаксация бяха оценени, както е описано по-горе ( 46 ). Специфичната сила се изчислява, като се използва площта на напречното сечение на миофибъра, описана по-долу, след жертване. Мишките се движат на бягаща пътека (Exer3/6 без решетки за електрическа стимулация, Columbus Instruments) при наклон от 15° с начална скорост от 1 m/min. Скоростта беше увеличена с единици от 3 m/min на стъпки от 2 минути до крайна скорост от 15 m/min. Анализът беше прекратен, когато мишките спрат за повече от 15 секунди върху подложката за почивка и не могат да бъдат подтикнати да се върнат към движение. Броят пъти, когато една мишка е трябвало да бъде подтикната да бяга, е записан и докладван като стимули на километър бягане. Експериментите с бягаща пътека бяха проведени 2 дни след последната седмична инжекция, започваща в 8:30 сутринта. Съставът на тялото беше оценен преди и по време на лечението, което се извършва всеки месец 1 ден след последната седмична инжекция в 13 часа. Процентът мастна маса, процентът на чиста маса и съотношението на хидратация се определят при неанестезирани мишки с помощта на MRI (EchoMRI). За всички анализи на мускулната механика, бягащата пътека и състава на тялото операторът беше заслепен за групата на лечение.

FDB изолиране и зареждане с багрило с калциев индикатор. Мускулът FDB се дисектира от възглавничките на краката на задните крайници на мишка и се инкубира в DMEM (SH30022.01, HyClone) с 2 mg/mL BSA (SLBT0167, Sigma-Aldrich) и 40 mg/mL колагеназа II (17101-015, Invitrogen) и се инкубира при 37°C с 10% _CO2 за 90 минути ( 84 ). FDB мускулите се преместват в разтвор на Ringer (123 mM NaCl, 2 mM CaCl2 _, 5 mM KCl, рН 7.4) и се стриват, за да се изолират отделни миофибри. MatTek 10-mm съдове със стъклено дъно бяха покрити с 20 μg/mL ламинин за 1 час (23017-015, Gibco), след което FDB бяха залепени към повърхността за 30 до 45 минути при 37°C с 10% CO ₂ . След 1 час, средата беше заменена с 300 μL разтвор на Ringer с 6 g/L глюкоза и 1% пеницилин/стрептомицин за инкубация за една нощ при 37°C, поддържана в инкубатор с 5% _CO2 . Устойчивото на течове Indo-1-AM (145, TEF Labs) цитозолно калциево индикаторно багрило се ресуспендира в DMSO и 10% Pluronic. FDB мускулите се зареждат с 5 цМ Indo-1 за 45 минути в инкубатор при 37°C с 10% CO ₂ .

Измервания на калциев преход и скъсяване на саркомера. Изолирани FDB мускули, натоварени с багрило Indo-1, бяха изобразени на обърнат микроскоп Nikon Diaphot, оборудван с високоскоростна камера и фотоумножителни тръби, интегрирани със системата FluoroDaq (IonOptix), за измерване на цитозолни калциеви преходни процеси и клетъчно скъсяване, както е описано по-горе ( 85 ). Мускулите на FDB се управляват с платинени електроди, предназначени за 35-mm MatTek чинии и свързани към високоволтов последващ стимулатор (701C, Aurora Scientific). Клетките се управляват при 40 Hz за 100 ms, като се използва 0,2 ms ширина на импулса при 18 до 20 V. Използва се система за дължина на видео саркомер (900B, Aurora Scientific) за измерване на разстоянието между саркомерите от изображения в светло поле, използвайки бърза трансформация на Фурие. Модулът за анализ на калциева флуоресценция 950A на Aurora Scientific беше използван за записване на калциеви преходни процеси и данни за скъсяване на дължината на саркомера и за анализ на параметрите на средните преходни процеси. Изолирането на FDB и преходните измервания на калция бяха извършени на сляпо за лекуваната група.

HPLC. Мускулът Gastrocnemius се замразява бързо веднага след умъртвяването и след това се пулверизира на прах с помощта на хаванче и пестик, охладен върху сух лед. Екстракцията и неутрализацията се извършват, както е описано по-горе ( 86 ). NAD+ и ATP бяха измерени чрез HPLC, както е описано по-горе (20 ) от оператор, заслепен за лекуваната група.

Хистология и имунофлуоресцентна микроскопия. Площта на напречното сечение за бяла мастна тъкан беше оценена от оцветяване с хематоксилин и еозин на 10-μm парафинови срезове, изобразени с Zeiss Axio Observer Z1 при 10× (LD A-Plan 10×/0.25 Ph1, Zeiss) за количествено определяне и 20× (Plan-Apochromat 20×/0.8, Zeiss) за представителни изображения. Площта на напречното сечение на адипоцитите беше измерена ръчно във Фиджи ( 87 ) от 3 изображения на животно. Процентът на влакна, положителни за сукцинат дехидрогеназа, беше оценен от 10-μm криосекции на tibialis anterior, инкубирани с натриев сукцинат и нитросин тетразолий при 37°C за 90 минути. Две цели секции от всяко животно бяха изобразени като 10× плочки (EC Plan-Neofluar 20×/0.3, Zeiss) с помощта на Zeiss Axio Imager M2; представителни изображения са направени при 20× (Plan-Apochromat 20×/0.8, Zeiss). Типът влакна се оценява чрез имунофлуоресценция; накратко, 10-μm серийни криосекции на tibialis anterior се фиксират в ацетон и след това се инкубират за една нощ с първични антитела срещу Myh7 (1:10), Myh2 (1:30), Myh4 (1:10) и Myh1 (1:30) (BA-F8, SC-71, BF-F3 и 6H1, съответно; Хибридома за изследвания на развитието Банка) при 4°C. След това срезовете се инкубират с вторични антитела Alexa Fluor 488 кози анти-миши IgG1 и Alexa Fluor 594 кози анти-миши IgM (A21121 и A21044, Life Technologies). Две цели секции от всяко животно бяха изобразени като 10 × плочки със Zeiss Axio Imager M2. Броят на влакната, оцветени във всеки цвят, беше преброен на ръка във Фиджи. Площта на напречното сечение на скелетния мускул беше оценена от 10-μm криосекции на tibialis anterior, фиксирани в 4% параформалдехид (PFA) и инкубирани за една нощ с антитяло срещу дистрофин (1:1000; PA1-37587, Invitrogen) при 4°C. След това срезовете се инкубират с Alexa Fluor 488 магарешки анти-заешки IgG (A32790, Life Technologies). Две цели секции от всяко животно бяха изобразени като 10 × плочки със Zeiss Axios Imager M2 и след това площта на напречното сечение беше оценена с помощта на програмата MATLAB SMASH (88 ). Цялото оцветяване беше извършено, изобразено и анализирано с оператор, заслепен за лечението.

Събиране и анализ на серум. В края на лечението, мишките бяха гладни в продължение на 4 часа и кръвта беше събрана с хепаринизирана микрохематокритна капилярна тръба (22-362-566, Thermo Fisher Scientific). Кръвта се оставя да се съсири в продължение на 30 минути при стайна температура и след това се центрофугира в продължение на 5 минути при 12 000 g и 4°C. Плазмата се събира като супернатант и се използва за определяне на циркулиращия инсулин (NC9440604, Thermo Fisher Scientific), кортикостерон (ADI-900-097, Enzo Life Sciences), естрадиол (Calbiotech; проведено от Центъра за изследване на репродукцията на Университета на Вирджиния) и тестостерон (IBL; проведено от Центъра за изследване на репродукцията на Университета на Вирджиния). Кръвната захар се измерва от капка кръв, събрана от върха на опашката с глюкометър AimStrip Plus (Germaine Laboratories). Нивата на инсулин, кортикостерон, естрадиол и тестостерон бяха оценени от оператор, заслепен за групата на лечение.

Имуноблот анализ. Относителното изобилие на протеини и фосфорилирането се оценяват чрез имуноблотинг. Накратко, бързо замразените мускули се смилат на прах с помощта на охладен в сух лед хаван и пестик и след това се ресуспендират в 500 μL ледено студен 1× PBS с 1 mM CaCl2 _, 1 mM MgCl2 _или 1× RIPA (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0, 0,5 mM EGTA рН 8,0, 0,1% натриев деоксихолат, 140 mM NaCl) и коктейл от протеазен инхибитор без EDTA (11836170001, Sigma-Aldrich) и фосфатазен инхибитор (4906837001, Sigma-Aldrich). Тъканта се хомогенизира с помощта на TissueLyzer II (Qiagen) за 6 минути при 30 Hz, като се почива на всеки 2 минути. Пробите, хомогенизирани в RIPA, след това се инкубират с 1% Triton X-100 (9002-93-1, Sigma-Aldrich) и 0.1% SDS (L3771-500G, Sigma-Aldrich) за 1 час при 4°C. Пробите се центрофугират за утаяване на неразтворим материал и след това общият протеин на супернатанта се определя количествено с помощта на реагент на Брадфорд (5000205, Bio-Rad). Протеинът се разделя с помощта на 4%–15% градиент или 7,5% TGX гелове (4561086 и 4561026, Bio-Rad) и след това се прехвърля в PVDF мембрани (1620177, Bio-Rad) за 3 часа при 300 mA и 4°C. Блотовете се блокират за 90 минути при стайна температура в StartingBlock T20 (37543, Thermo Fisher Scientific) и се инкубират с първично антитяло, разредено в Т20, за една нощ при 4°C. Блотовете се промиват 4 пъти в 1 × TBS с 0,1% Tween 20 (TBST) (BP337-500, Thermo Fisher Scientific), инкубират се за 1 час при стайна температура с вторично антитяло, конюгирано с HRP, и се промиват отново в TBST. Блотовете се изобразяват с хемилуминесцентен субстрат SuperSignal West Pico (34080, Thermo Fisher Scientific), използвайки iBright CL1000 (Thermo Fisher Scientific). Общият протеин беше оценен с помощта на Pierce Reversible Protein Stain Kit (24585, Thermo Fisher Scientific). Денситометрията се извършва с помощта на Фиджи и протеинът се нормализира или към общата протеинова лента при 42 kDa, или като съотношение фосфорилиран към общ протеин.

Антителата, използвани за имуноблотинги, са изброени в допълнителна таблица 1 .

RNA-Seq анализ и количествена RT-PCR. Анализът на генната експресия се извършва върху РНК, извлечена от миофибри, изолирани от квадрицепс с TRIzol (15596018, Life Technologies). Накратко, непосредствено след прибиране на реколтата, десният квадрицепс беше нарязан наполовина и след това нарязан, следвайки естествената ориентация на миофибрите, преди да бъде инкубиран в колагеназа II за 1 час при 37°C. Мускулът беше ръчно дисоцииран и след това филтриран през 40-μm клетъчна цедка (22-363-547, Thermo Fisher Scientific). Нефилтрираната фракция се събира и обработва с TRIzol. След това РНК се изолира с помощта на PureLink RNA Mini Kit (Thermo Fisher Scientific) съгласно инструкциите на производителя и се ресуспендира в 30 μL вода без РНКаза. Контролите на качеството, секвенирането, подравняването до mm10 и количественото определяне на броя на прочетените и броя на милион бяха извършени, както е описано по-горе ( 46 ). Необработените показания са налични в базата данни Gene Expression Omnibus на NCBI (GEO GSE168964). Топлинните карти бяха визуализирани от z резултати с медиани в RStudio ( 89 ). Анализът на GO беше извършен чрез модула Wiki Pathways Mouse 2019 в Enrichr (90 ,91 ). Резултатите от RNA-Seq бяха валидирани чрез количествена RT-PCR с праймери, изброени в допълнителна таблица 2, като се използва iTaq Universal SYBR Green Supermix (1725124, Bio-Rad). Резултатите от RT-PCR за всеки ген се докладват като кратна промяна, нормализирана към средната стойност на пробите, третирани с носител. Корелацията между генната експресия и фенотипните данни беше оценена с помощта на фено-РНК (22 ). Гени с логаритмичен брой на милион по-голям от 2,5 и абсолютна логаритмична промяна по-голяма от 0,5 (721 жени, 470 мъже) бяха използвани за анализа заедно със специфична сила, време на релаксация и време на свиване. Коефициентът на корелация на Pearson се изчислява за всеки ген и фенотип при 3 животни от пол на група за лечение. Контролна група беше генерирана чрез разместване на броя на милион между пробите, както е описано в оригиналната публикация (22 ).

ChIP-qPCR анализ. ChIP се извършва върху хроматин, изолиран от бързо замразен цял ляв квадрицепс. Мускулът се смила на прах върху сух лед и след това се хомогенизира 6 пъти в 2 тМ дисукцинимидил глутарат (20593, Thermo Fisher Scientific) в хомогенизатор на лед. Мускулният хомогенат се филтрира първо през 100-μm и след това 40-μm клетъчна цедка (22-363-549 и 22-363-547, Thermo Fisher Scientific) и филтратът се инкубира в продължение на 20 минути при стайна температура. Клетките се пелетират и след това се ресуспендират в 1% PFA за 5-минутно фиксиране при стайна температура. Пелетите се ресуспендират в Fast IP буфер (5 mM EDTA pH 7,5, 50 mM Tris pH 7,5, 0,05% NP-40, 150 mM NaCl) и се лизират чрез преминаване през стерилна BD Micro-Fine IV инсулинова спринцовка (14-829-1A, Thermo Fisher Scientific) два пъти. Хроматинът се срязва чрез Bioruptor Ultrasonicator (Diagenode), 6 цикъла, 30 секунди включване/изключване и след това се завърта надолу, за да се отстранят примесите. Супернатантата се разделя наполовина и се инкубира с 6 μg анти-GR антитяло (sc-393232, Santa Cruz Biotechnology) или IgG2B изотипна контрола (MAB004, R&D Systems) за една нощ при 4°C, с 5% запазени като вход. Протеинови A/G магнитни перли (88803, Thermo Fisher Scientific) бяха предварително блокирани с 0.5% BSA в PBS за една нощ при 4°C. След инкубация за една нощ, сместа антитяло-хроматин се добавя към магнитните перли и се инкубира в продължение на 6 часа при 4°C. Зърната се промиват 6 пъти с ледено студен бърз IP буфер, два пъти с ледено студен ТЕ рН 8.0 и след това се елуират при стайна температура (105 тМ натриев бикарбонат, 1.05% SDS). След инкубиране в продължение на една нощ при 65°C за обръщане на кръстосаните връзки, ДНК се пречиства с QIAquick PCR Purification Kit (28106, Qiagen) и се елуира с 30 μL EB. GR обогатяването се определя като процентно въвеждане чрез количествена PCR. Положителните и отрицателните контролни локуси, както и идентифицираните предполагаеми GREs са изброени в допълнителна таблица 3 .

ChIP-Seq анализ. ChIP се извършва на 2 биологични повторения на група за лечение върху изолирани миофибри от левия квадрицепс. Накратко, миофибрите се изолират, както е описано по-горе и след това се замразяват бързо след филтриране. Моментално замразените миофибри се смилат на прах върху сух лед и след това се фиксират в 1% PFA за 5 минути при стайна температура. Хроматинът се изолира и срязва, както е описано по-горе, преди да се инкубира с 5 μg анти-H3K27ac антитяло (39133, активен мотив) за една нощ при 4°C, с 5% запазени като вход. Имунопреципитацията се извършва, както е описано по-горе, с промивен буфер с високо съдържание на сол (50 mM Tris рН 7.5, 500 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% Triton X-100). Контролът на качеството, подготовката на библиотеката и секвенирането бяха извършени, както е описано по-горе ( 20 ). Четенията бяха подрязани, за да се премахнат последователностите на адаптера TruSeq с homerTools (92 ) и след това подравнени до mm10 с Bowtie2 (93 ,94 ). Пиковете бяха извикани с HOMER с помощта на командата findPeaks с параметри -style histon -F 2 с директории на входни тагове, използвани като контроли. Пиковете, уникални за седмично третирани с преднизон скелетни мускули, бяха идентифицирани чрез сравняване на пикови файлове с носител и седмично третирани с помощта на mergePeaks с даден параметър -d. Значително обогатени мотиви бяха идентифицирани с помощта на findMotifsGenome с параметри -size given -mask. Необработените четения и пиковите файлове са налични в базата данни GEO (GSE188302). Регионите, наречени пикове или не пикове, бяха валидирани чрез qPCR с помощта на праймери, изброени в допълнителна таблица 3 .

LC-MS/MS анализ. Ненасочена липидомия се извършва върху мускули от женски мишки, третирани в продължение на 4 седмици с носител или седмично преднизон. Четириглавият мускул беше бързо замразен и след това смлян на прах с охладен в сух лед хаван и пестик. Замразените проби бяха изпратени върху сух лед до ядрото за масова спектрометрия в Университета на Илинойс в Чикаго, където бяха извършени LC-MS/MS и анализ на данните. Накратко, 10 μL от SPLASH Lipidomix бяха добавени като вътрешен стандарт преди екстракцията. Липидните екстракти се изсушават и ресуспендират в 100 μL метанол/хлороформ (9:1, v/v) преди анализ. MS анализът на суровите липидни екстракти беше извършен с помощта на система Agilent 6545 Q-TOF LC-MS, контролирана от софтуера за придобиване на Agilent Mass Hunter. Масспектрометърът работи в режим на разширен динамичен обхват от 2 GHz, като се използва анализ на прекурсорни йони за относителни експерименти за количествено определяне в режим на положителни йони. В режим на положителни йони бяха използвани вътрешни еталонни йони за калибриране на масата m / z 121.0509 и 922.0098. Подвижна фаза А беше Н20 _/ метанол (90:10, v/v) с 10 mM амониев ацетат и 0.5 mM амониев флуорид. Подвижна фаза В е изопропанол/метанол/ацетонитрил (5:3:2, v/v/v) с 10 mM амониев ацетат и 0.5 mM амониев флуорид. Ресуспендираните липидни екстракти (2 μL) се зареждат в 2,1 × 100 mm Agilent Poroshell C18, 2,7 μm колона (Agilent Technologies Inc.) и сепарирането се извършва с помощта на система Agilent 1290 UPLC със следния градиент: 70% B при 0–1 минута, 86% B при 3,5–10 минути, 100% B на 11–17 минути, при скорост на потока 400 μL/min. Време за еквилибриране след колоната от 5 минути беше използвано за всички серии. Параметрите на източника бяха както следва: температура на газа 200°C, изсушаващ газ 11 L/min, пулверизатор 35 psi, температура на обвивния газ 350°C, поток на обвивния газ 12 L/min, VCap 3000 V и фрагментатор 145 V. Данните бяха събрани за относително количествено определяне, като се използва скорост на сканиране от 4 MS спектра в секунда. Обединените проби бяха приготвени чрез комбиниране на 5 μL от всяка от пробите и беше извършен итеративен MS/MS работен поток в софтуера за придобиване на Mass Hunter през 6 инжекции на обединените проби със скорост на сканиране от 10 MS и 3 MS/MS спектра в секунда.

Анализ на липидомични данни. Суровите LC-MS/MS данни бяха използвани за създаване на базирана на фрагментация (MS/MS) библиотека, съдържаща m / z прекурсори и времена на задържане за всички идентифицирани с MS/MS липиди с помощта на софтуера Lipid Annotator (Agilent Technologies Inc.) и следните настройки: липидни видове за положителни ([M + H] ⁺ , [M + Na] ⁺ , [M + NH ₄ ] ⁺ , [M + H – H ₂ O] ⁺ , [M + Na – H ₂ O] ⁺ , [M + NH ₄ – H ₂ O] ⁺ ), Q резултат от 60 или повече и масово отклонение от 10 ppm или по-малко. Необработените LC-MS файлове с данни бяха обработени с помощта на софтуера Profinder (vB.10.00, Agilent Technologies Inc.). Тук молекулярните характеристики бяха извлечени за пикове с 5000 или повече отброявания в положителен режим ([M + H] ⁺ , [M + Na] ⁺ , [M + NH ₄ ] ⁺ , [M + H – H ₂ O] ⁺ , [M + Na – H ₂ O] ⁺ , [M + NH ₄ – H ₂ O] ⁺ ), използвайки изотопен модел на обикновени органични молекули (не халогени). Полученият списък на съединенията беше допълнително филтриран за онези, които имат абсолютна височина от 10 000 отброявания или повече, качествен резултат от 60 или по-висок и съединения, имащи 2 или повече налични изотопа. Освен това, времето на задържане за всяко съединение беше приведено в съответствие с ±0,1 минути, като се използва прозорец за точност на масата от 5,0 ppm или по-малко и пикове, интегрирани с помощта на Agile интегратора в софтуера Profinder. Всеки от интегрираните пикове беше прегледан ръчно за време на задържане и съпоставяне на фрагментацията. След това обработеният файл с данни беше експортиран като .cef и импортиран в софтуера Mass Profiler Professional (v15.1, Agilent Technologies Inc.), където всеки набор от данни беше анализиран отделно. Всички стойности на изобилието на съединението бяха базови, коригирани към средното изобилие и нормализирани от най-близкия липиден стандарт. Съединения, които не присъстват във всички биологични реплики на която и да е група за лечение, бяха допълнително филтрирани. Отклоненията бяха идентифицирани чрез Q теста на Dixon и отклоненията, попадащи извън 95% доверителен интервал, бяха премахнати. Съединенията, представляващи интерес, са идентифицирани чрез t теста на Welch като имащи P стойност по-малка или равна на 0,05 и са изброени в допълнителна таблица 4 .

Статистика. Статистическите анализи бяха извършени с Prism (GraphPad). Когато се сравняват 3 групи, анализите бяха извършени или като 1-way ANOVA (за лечение като единствена променлива) или като 2-way ANOVA (за време и лечение като променливи). При сравняване на 2 групи е използван тестът на Mann-Whitney-Wilcoxon. За анализи с малък брой проби беше използван t тест на Welch с. За ANOVA и t тест анализи, P стойност по-малка или равна на 0,05 се счита за значима, въпреки че всички P стойности по-малки от 0,1 са докладвани в цифри. Точковите диаграми и маркираните линейни графики изобразяват средно ± SD.

Одобрение на изследването. Проучването е проведено с одобрението на Комитета за институционална грижа и използване на животните към Северозападния университет.